Клеточные технологии в гинекологии

Зачем нужны изолированные клетки

Объектом биологических и молекулярно-биологических исследований являются живые организмы, но работа с ними довольно трудна. Во-первых, это дорого и долго. Во-вторых, изучать молекулярные механизмы в живом организме чрезвычайно сложно из-за колоссального числа взаимосвязанных компонентов и низкого разрешения методов анализа: очень сложно выделить эффекты одного изучаемого процесса из миллионов других событий, происходящих в том же организме в то же время.

Составными частями организма являются органы, которые в свою очередь состоят из тканей, а те — из клеток (рис. 1). В настоящее время исследователи учатся создавать трехмерные тканевые структуры [1–3], но до выращивания полноценных органов in vitro пока далеко. Выделение отдельных органов и поддержание их жизнедеятельности вне организма пока более сложная задача, чем их исследование в составе организма.

Поэтому наиболее распространенным модельным объектом молекулярно-биологических исследований в наше время являются клеточные культуры. Клеточная культура — это клетки (как правило, клетки животных или человека, принадлежащие одной ткани), выращиваемые обычно в пластиковых флаконах, планшетах или чашках Петри в специальной питательной среде при контролируемых температуре, влажности и уровне углекислого газа (рис. 2).

Клеточные культуры многочисленны, разнообразны, доступны, относительно просто культивируются. Для них легко контролировать внешние условия и воздействовать изолированными стимулами, а для анализа имеется богатый арсенал методов. Многие методы при работе с клетками позволяют получить принципиально новую информацию, нежели при изучении организма, срезов или гомогенатов ткани.

Помимо этого, культуры клеток нашли широкое применение в биотехнологиях, производстве лекарств и вакцин. За последние 10 лет запущено около тысячи клинических испытаний протоколов клеточной терапии (то есть пересадки клеток для лечения заболевания), для некоторых из которых уже доступны результаты (на сайте clinicaltrials.gov и по ссылкам на странице исследования). Очевидно, что за клеточной терапией будущее, и она откроет медицине недоступные прежде рубежи.

А на рисунке 3 показана краткая история развития клеточных технологий.

Клеточные технологии в лечении повреждений кожи

Среди наиболее перспективных и успешных областей применения клеточных технологий особо выделяется лечение повреждений кожи – уже десятки и даже сотни тысяч пациентов в мире получили терапию кожи клеточными препаратами. К примеру, препарат Apligraf®, США (дермальный эквивалент кожи, включающий аллогенные кератиноциты и дермальные фибробласты) использовали при лечении хронических язв более чем  250 тысяч пациентов;

Клеточные технологии в гинекологии

К настоящему времени разработаны клеточные технологии, в основе которых лежит применение не только культивированных клеток (о которых речь шла выше) но и клеток, получение которых происходит без культивирования. Так, в частности,  австралийская биотехнологическая компания Avita Medical изобрела прибор ReCell, который позволяет в течение 30 мин из небольшого биоптата кожи пациента получить суспензию, состоящую из 3-х популяций клеток (кератиноцитов, фибробластов, меланоцитов).

Активно ведутся разработки и в направлении лечения таких тяжелых заболеваний кожи, как буллезный эпидермолиз – генетически обусловленное заболевание, связанное с нарушением продукции коллагена VII типа, ответственного за сцепление дермы с эпидермисом. Первые положительные результаты показали, что трансплантация эпидермальных аутографтов (аутологичных стволовых эпидермальных клеток, генетически модифицированных посредством трансдукции в них ex vivo нормальной копии дефектного гена) привела к коррекции патологии и, вероятно, сможет эффективно помочь в борьбе с этим смертельным заболеванием.

Словарик

Адгезивная клеточная культура
клеткам которой для роста необходимо прикрепиться к поверхности лабораторной посуды (пластика) или друг к другу.
Внеклеточный матрикс
внеклеточное вещество, состоящее из жестких белковых фибрилл и полисахаридного гидрогеля.
Гибридомы
гибриды, полученные в результате слияния B-клеток и раковых клеток миеломы.
Дифференцировка (клеточная)
процесс созревания клеток с приобретением ими узкоспециализированных функций.
Иммортализованная культура
клетки которой способны делиться без ограничения.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК)
плюрипотентные клетки, полученные из клеток зрелого организма. Это могут быть клетки разной степени дифференцировки, включая терминальную. Для индукции плюрипотентности в эти клетки вводят особые гены, воздействуют химическими и механическими стимулами или комбинируют эти факторы.
Клеточная культура
клетки в условиях in vitro.
Клеточный клон
культура однородных клеток с единым предком.
Клеточная линия
клеточная культура, состоящая из однородных клеток.
Лимит Хейфлика
лимит, ограничивающий число делений клеток, составляющий 50–70 делений для клеток человека. Обусловлен укорочением теломер.
Мезенхимальные клетки
клетки соединительной ткани (стромы), способные дифференцироваться в клетки костей, хрящей, мышц и жировые клетки.
Органоид
трехмерное образование из разнородных клеток, похожее по строению на миниатюрный орган (или его часть) и образованное in vitro из стволовых клеток путем самоорганизации. В русском языке органоидами также называют внутриклеточные органеллы.
Пассаж
интервал между повторными пассированиями клеток.
Пассирование
разведение клеточной культуры, которое для адгезивных клеток сопровождается разрывом межклеточных связей и связей клеток с поверхностью.
Первичная культура
культура, выделенная из организма и не пассированная in vitro.
Плюрипотентные клетки
клетки, способные дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков (эндодермы — будущие внутренние органы, мезодермы — будущие мышцы, кости, кровь и мочеполовые органы и эктодермы — будущие нервная система и эпителиальные ткани), но не в клетки внезародышевых органов (плацента и желточный мешок).
Пролиферация
деление клеток без изменения их свойств.
Раковые клетки
клетки, полученные из опухолей и, как правило, способные к неограниченному числу делений in vitro.
Рекомбинантные белки
белки, полученные с помощью живых клеток в результате внедрения в них генов этих белков.
Стволовые клетки
клетки-предшественники, способные дифференцироваться в клетки разной специализации.
Суспензионная культура
клетки которой могут расти в суспензии без прикрепления к поверхностям или друг к другу.
Сфероид (клеточный)
трехмерное образование из клеток сферической формы. В отличие от органоида состоит из однородных клеток и сформирован в результате специальных внешних воздействий (обычно перемешивания), а не благодаря самоорганизации.
Теломеры
концевые фрагменты хромосом, которые состоят из повторяющихся последовательностей нуклеотидов (TTAGGG) и укорачиваются при каждом делении клетки.
Теломераза
фермент, который наращивает теломеры.
Трансдукция
внедрение генов в клетки с помощью вирусов.
Трансдифференцировка
изменение специализации зрелых клеток.
Трансфекция
внедрение генов в клетки без использования вирусов.
Фидер
поверхность из умерщвленных клеток (обычно — мышиных эмбриональных фибробластов, убитых радиацией или цитостатиком), на которую сажают стволовые клетки для поддержания их недифференцированного состояния и получения эмбриодных телец.
Эксплант ткани
кусок ткани с живыми клетками, помещенный в питательную среду in vitro.
Эмбриоидные тельца
трехмерные образования из недифференцированных эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)
плюрипотентные клетки, полученные из эмбриона.

Применение в биомедицине

Производство вакцин

Именно производство вакцин активизировало развитие клеточных технологий в 1950–1960-х годах. Первая вакцина, произведенная в линии клеток человека — против краснухи (1970 год). Для ее создания Стэнли Плоткин заражал клетки WI-38 вирусом и растил их при 30 °C [37], что позволило отобрать штамм вируса, приспособленный именно к этой температуре, а не к физиологическим 37 °C, при которых вирус погибал.

Аналогично вирусам клетки могут производить и отдельные белки, но, в отличие от вирусов, белки не способны сами себя воспроизводить в клетках. Чтобы клетка начала производить нужный белок в нее необходимо внедрить ген этого белка (см. раздел «Как доставить ген в клетку?»). В этом заключается суть биотехнологического производства, при котором клетки программируются на генетическом уровне на выработку того или иного белка. Полученные таким образом белки называют рекомбинантными.

Сегодня наиболее распространенный тип клеток, используемый для производства рекомбинантных белков, — клетки бактерий, а именно кишечная палочка Escherichia coli (рис. 24а). Преимуществами этих клеток являются: быстрая скорость размножения (около 30 мин), высокая плотность культуры, простой состав питательной среды и большое удельное количество производимого белка на клетку.

Бактерии, однако, способны правильно производить далеко не всякие белки. Дело в том, что конвейер по производству белков в бактериях существенно проще, чем у других, более сложных организмов. Во-первых, для сворачивания длинной полипептидной нити в правильную трехмерную форму в клетке присутствуют специальные помощники — шапероны, а у бактерий этих шаперонов меньше и они отличаются от эукариотических.

https://www.youtube.com/watch?v=KuM1ibAtBvU

Во-вторых, у бактерий отсутствует стадия пост-производственной доработки белков, на которой видоизменяются некоторые участки, навешиваются сахара и липиды и удаляются вспомогательные последовательности. В-третьих, многие белки (например, антитела) для правильного функционирования требуют объединения фактически нескольких белков (субъединиц) в один, а бактерии не могут этого сделать с чужеродными для них белками.

Для производства сложных белков предпочтительно использовать клетки, наиболее похожие на те, которые производят их в естественных условиях. Так, для производства антител используют гибриды B-клеток (см. дальше). Для производства человеческих рекомбинантных белков сейчас используют несколько клеточных линий, условия культивирования и питательные среды для которых подобраны так, чтобы обеспечить максимальный выход продукта.

Наиболее распространенной линией является линия клеток яичника китайского хомячка CHO (рис. 24в), которая может расти как прикрепившись к поверхности, так и в суспензии. Вполне естественно, что за качество надо платить. Количество белка, получаемого из литра среды клеток млекопитающих, примерно в 10 раз ниже, чем из литра бактерий, а его производственная стоимость возрастает в десятки раз.

Некоторым компромиссом между клетками млекопитающих и бактериями являются дрожжи (рис. 24б), которые почти так же быстро делятся, как и бактерии (~2 ч) и тоже не очень требовательны к питательной среде. Дрожжи, как и человеческие клетки, — эукариоты (имеют клеточное ядро) и обладают аппаратом, необходимым для полного цикла производства человеческих белков.

Однако многочисленные мелкие отличия этого аппарата у дрожжей и млекопитающих требуют оптимизации процесса для каждого отдельного белка. Это, наряду с невысоким выходом продукта, делает дрожжи не самой распространенной биотехнологической системой. Другими возможными альтернативами клеткам млекопитающих являются клетки насекомых и растений.

Наибольшая часть разрабатываемых сегодня терапевтических препаратов — это рекомбинантные белки, и около 60% из них производится именно в клетках млекопитающих. В 2016 году из 10 лидирующих по суммам продаж препаратов 7 являются рекомбинантными белками, а 5 из них произведены в клетках CHO (см. таблицу).

В этом списке преобладают рекомбинантные антитела, что обусловлено относительной предсказуемостью их активности. В отличие от большинства других биологически активных молекул, антитела взаимодействуют только с одной мишенью, которую они связывают с исключительной избирательностью и прочностью, в результате чего просто ее «выключают».

Получение рекомбинантных антител все еще довольно трудоемко, и поэтому для большинства задач антитела производят с помощью гибридoм.

Таблица. Топ-10 препаратов по объему продаж в 2016 году.Построена по [38], [39] и «Википедии».
Препарат Класс Назначение Продуцент Объем продаж, $ млрд.
1 Адалимумаб (Adalimumab) Рекомб. антитела Аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата СHO 16,1
2 Ледипасвир Софосбувир (Ledipasvir/ Sofosbuvir) Синтетич. молекула Гепатит С 9,1
3 Этанерсепт (Etanercept) Рекомб. белок Аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата СНО 8,9
4 Инфликсимаб (Infliximab) Рекомб. антитела Аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата Гибридома 8,2
5 Ритуксимаб (Rituximab) Рекомб. антитела Онкология СНО 7,2
6 Леналидомид (Lenalidomide) Синтетич. молекула Онкология 7,0
7 Бевацизумаб (Bevacizumab) Рекомб. антитела Онкология CHO 6,7
8 Трастузумаб (Trastuzumab) Рекомб. антитела Онкология CHO 6,7
9 Инсулин гларгин (Insulin glargine) Рекомб. белок Диабет E. coli 6,1
10 Превенар 13 (Prevеnar 13) Полисахаридная вакцина Вакцина против пневмококка 5,7

Антитела вырабатываются B-лимфоцитами в ответ на иммунизацию, то есть введение в организм антигена. Антитела можно выделить непосредственно из плазмы крови иммунизированного животного, которая содержит примерно 10 мг/мл антител. Антитела из плазмы крови называют поликлональными и широко применяют для научных исследований, однако для клинической диагностики они не годятся по двум причинам: 1) они не стандартизованы и 2) для клинической диагностики обычно нужна пара разных антител на один антиген.

Клеточная терапия

Применение клеток в лечении — клеточная терапия — имеет довольно долгую историю. На своей заре эти методы не имели почти никаких юридических ограничений, поскольку применялись крайне редко, а научный прогресс существенно опережал законотворчество. Еще в XVII веке Жан-Батист Дени переливал кровь от овцы человеку.

Клеточные культуры: как их получать и для чего использовать?

Прежде чем перейти к методам, рассмотрим, что собой представляют клетки in vitro и чем они отличаются от клеток в составе организма. Это важно, так как конечная цель экспериментов на клетках — понимание молекулярных механизмов функционирования именно организма, а не клетки. Переход от клеток к организму гораздо сложнее, чем может показаться на первый взгляд. По ходу статьи мы еще будем возвращаться к этому вопросу, а сейчас рассмотрим некоторые общие моменты.

Живой объект состоит из более мелких составных частей: органов, тканей, клеток, органелл, биомолекул и одновременно является частью более масштабных систем — таких как пищевые цепочки, экосистемы, сообщества. Еще Гиппократ и Аристотель задавались вопросом соотношения целого и его частей и сошлись в понимании, что целое есть больше, чем сумма частей.

https://www.youtube.com/watch?v=Igcas8hEv0M

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Zeleno-Mama.ru
Adblock
detector